药典中桔梗皂苷D的分析探索：检测器、进样量、有机相、柱温和色谱柱
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桔梗药材为桔梗科植物桔梗的干燥根。春、秋二季釆挖，洗净，除去须根，趁鲜剥去外皮或不去外皮，具有干燥。宣肺，利咽，祛痰，排脓。用于咳嗽痰多，胸闷不畅，咽痛音哑，肺痈吐脓的功效。
2020版中国药典一部规定以蒸发光散射检测器（ELSD）检测，理论塔板数按桔梗皂苷D峰计算应不低于3000。
桔梗皂苷D
选用柱流失更小的CAPCELL PAK C18 MGIII S5;4.6mm i.d.×250mm色谱柱，使用高灵敏度气溶胶检测器NQAD，对对照品和供试品进行了测定。
结果如图1所示，桔梗皂苷D对照品以10 μg/mL进样，得到色谱峰理论塔板数为16606，不对称因子为 0.96。供试品中桔梗皂苷D理论塔板数为21085，不对称因子为1.02 ，与前后基质峰分离度分别为 1.52和1.89，符合药典理论塔板数不小于3000要求。
图1 对照品与供试品分析色谱图
【液相条件】
色谱柱：CAPCELL PAK C18 MGIII S5;4.6mm i.d.×250mm
流动相：水 / 乙腈=76 / 24
流 速：1.0 mL/min
温 度：35℃
检 测：NQAD，气化温度30℃，蒸发温度35℃，filter 5
对照品：桔梗皂苷D，10 μg/mL（溶剂：甲醇）
供试品：按药典要求配置
进样量：10 µL
讨 论
1、关于线性和定量限
药典中以ELSD检测器进行检测，由于ELSD为对数相应，因此药典在测定法中规定，分别精密吸取对照品溶液10 μL、20 μL，供试品溶液10～15 μL，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
对于NQAD检测器来说自身为线性响应，因此我们直接以4、20、100、500 μg/mL浓度下，分别进样10 μL，验证线性区间和线性方程，得到线性如图2所示。在4-500 μg/mL浓度范围内，r=0.9998，线性良好。以S/N=10计算定量限约为3.1 μg/mL（31ng）。
图2 对照品线性图
2、关于进样量
以不同进样体积进样时，由于溶剂效应的影响，在20 μL进样量下色谱峰容易出现前延，导致峰面积较实际值小的问题，以该方式定量计算有可能造成较大误差。
图3 不同进样量下峰型变化
3、有机相比例
有机相比例对保留时间影响较大，即使只有1%的有机相变化，保留时间差别在10min左右。因此，在不同仪器或不同人员配置时，有可能由于比例的微小误差导致不同的实验结果。
为了获得桔梗皂苷D与前后基质良好分离，我们最终选择了24%乙腈比例进行分析。
图4 不同有机相比例对比
4、柱温影响
柱温越低，保留时间越长，但对分离情况影响不大。
图5 不同柱温比较
5、色谱柱影响
在尝试不同类型色谱柱时，发现在气溶胶检测器下，使用不同C18键合色谱柱得到的谱图基线有一定差别，使用柱流失更小的色谱柱（C18 MGIII）有利于得到平稳基线和更好信噪比结果。
图6 不同色谱柱对比结果
NQAD和ELSD的灵敏度对比
ELSD（蒸发光散射检测器）作为一种通用型检测器被大家广泛认可，在使用中无需待测物具有发色基团，具有对温度变化不敏感、基线稳定等特点，但由于其灵敏度和重现性较差，在使用中也会对研究者造成困扰。
而NQAD通过放大待测物的颗粒体积得到了更高的灵敏度。下图为不同有机相（乙腈）比例下对0.1 mg/mL三氯蔗糖进行测定时，信噪比的变化示意图。从图中可以看到，在0-80%的乙腈比例内，NQAD的信噪比远大于ELSD（在60%乙腈比例时达到峰值）。实验中80%乙腈下，NQAD的灵敏度较ELSD提高了近50倍。
参考文献：
J.P. Hutchinson, J. Li, W. Farrell, E. Groeber, R. Szucs, G. Dicinoskia, P.R. Haddad,Comparison of the response of four aerosol detectors used with ultra highpressure liquid chromatography, J. Chromatogr. A 1218 (2011) 1646–1655.