即将执行8.2化妆品中α-熊果苷等4种原料的检验方法 的CP柱数据分享
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近日，国家药品监督管理局发布了“国家药监局关于将油包水类化妆品的pH值测定方法等21项制修订项目纳入化妆品安全技术规范（2015年版）的通告（2023年第41号）”。
对《化妆品安全技术规范（2015年版）》中原有的5项检验方法进行了修订，自2024年3月1日起，化妆品注册、备案及抽样检验相关检验应当采用新发布的检验方法。
新增14项检验方法，纳入《化妆品安全技术规范（2015年版）》，自通告发布之日起实施。
今天给大家带来的是“化妆品中α-熊果苷等4种原料的检验方法”的数据分享。
使用CAPCELL PAK MGIII C18色谱柱可以得到α-熊果苷、β-熊果苷相对较好的分离，目标峰线性、回收率良好。
使用CAPCELL PAK ADME-HR色谱柱，对色谱条件做一些调整后，方法验证可得到良好分析结果，线性、回收率良好，同时α-熊果苷和β-熊果苷的分离度可达到3.58，并缩短了整体分析时间。
01
- 不同保留机理色谱柱的比较
首先使用不同保留机理的色谱柱对α-熊果苷和β-熊果苷的分离效果进行比较。
在常规C18体系下，CAPCELL PAK C18 MGIII可以得到较好的分离效果，而使用键合金刚烷基团的CAPCELL PAK ADME-HR（金刚烷键合）色谱柱，在相同液相条件下能得到更好的分离效果，分析结果如图1所示。
图1 C18 MGIII和ADME-HR色谱柱
α-熊果苷、β-熊果苷对照品分析结果对比图
【色谱条件】
色谱柱：CAPCELL PAK C18 MGIII S5;4.6×250
CAPCELL PAK ADME-HR S5;4.6×250
流动相：水 / 甲醇 = 95 / 5
流速：0.5 mL/min
柱温：20 ℃
检测：激发波长：292；发射波长：337
样品：α-熊果苷20μg/mL,β-熊果苷10μg/mL (溶剂为甲醇)
进样量：5 μL
02
参考检验方法得到的结果
参考检验方法中推荐的色谱柱类型和规格，使用CAPCELL PAK C18 MGIII色谱柱对标准品、乳液样品和化妆水样品进行分析，可获得良好的分析结果。
图2 MGIII色谱柱分析结果-标准溶液
1.β-熊果苷 2.α-熊果苷 3.氢醌 4.苯酚
表1 MGIII色谱柱标准溶液中各峰积分结果表
【色谱条件】
色谱柱： CAPCELL PAK MGIII C18, 4.6 mm×250 mm, 5 μm（A15AD 50006）
流动相：A：水 B：甲醇
B% 5%（0min）-5%（21min）->45%（22min）->50%（43min）->50%（48min）->100%（48.1min）->100%（50min）->5%（50.1min）->5%（60min）
流速：0.5 mL / min
柱温：20 ℃
进样量： 5μL
检测：α-熊果苷、β-熊果苷的激发波长为292，发射波长为337；
氢醌的激发波长为298，发射波长为345；
苯酚的激发波长为：280，发射波长为318
样品：α-熊果苷2μg/mL，β-熊果苷2μg/mL，氢醌0.2μg/mL，苯酚0.4μg/mL (溶剂为甲醇)
标准曲线
用甲醇将固体标准品溶解稀释配制成标准工作溶液，浓度依次由低向高进样测定，以峰面积-浓度作图，绘制标准工作曲线。标准曲线在浓度范围内线性良好，线性系数r的范围为0.9997~1.0000，测试结果如表2所示。
表2 α-熊果苷、β-熊果苷、氢醌和苯酚的线性方程、线性范围和相关系数
回收率
按照标准方法分别对化妆水和乳液样品进行加标回收实验，α-熊果苷和β-熊果苷添加量为20μg，氢醌添加量为2μg，苯酚添加量为4μg。对样品和加标样品进行分析，计算得到回收率结果，分析谱图如图3和图4所示。化妆水样品和乳液样品加标回收率范围为91.3%~108.9%，回收率良好。
图3 化妆水样品和化妆水加标样品分析图
1.β-熊果苷 2.α-熊果苷 3.氢醌 4.苯酚
图4 乳液样品和乳液加标样品分析图（样品中苯酚有值需要质谱确认）
1.β-熊果苷 2.α-熊果苷 3.氢醌 4.苯酚
【色谱条件】
色谱柱： CAPCELL PAK MGIII C18, 4.6 mm×250 mm, 5 μm（A15AD 50006）
流动相： A：水 B：甲醇
B%5%（0min）->5%（21min）->45%（22min）->50%（43min）->50%（48min）->100%（48.1min）->100%（50min）->5%（50.1min）->5%（60min）
流 速： 0.5 mL / min
柱 温： 20°C
进样量： 5μL
检 测： α-熊果苷、β-熊果苷的激发波长为292，发射波长为337；氢醌的激发波长为298，发射波长为345；苯酚的激发波长为280，发射波长为318
样 品： 称取样品1.0g（精确到0.001g），置10mL具塞比色管中，加入甲醇至10mL，在涡旋混匀器上高速振荡30s，使样品与提取溶剂充分混合。密塞，超声提取20min，静置至室温，取适量样品溶液离心（转速14000r/min）5min，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为待测溶液。必要时用适量甲醇稀释。
03
使用CP ADME-HR的结果
基于α-熊果苷和β-熊果苷差向异构的化学性质，使用键合金刚烷基团的CAPCELL PAK ADME-HR色谱柱，在检验方法的液相条件下能得到更好的分离效果，但保留时间较长，和氢醌峰接近，所以检验方法中的梯度条件不适合此款色谱柱，我们尝试在检验方法的基础上对色谱条件做一些调整，使目标峰能够获得更好的分离。通过相应的方法学验证后，发现新方法下线性、回收率良好，同时α-熊果苷和β-熊果苷的分离度可达到3.58，并缩短了测试时间。
图5 ADME色谱柱分析结果-标准溶液
1.β-熊果苷 2.α-熊果苷 3.氢醌 4.苯酚
表3 ADME色谱柱标准溶液中各峰积分结果表
【色谱条件】
色谱柱： CAPCELL PAK ADME HR, 4.6 mm×250 mm, 5 μm（V45HAD01279）
流动相： A：水 B：甲醇
B%13%（0min）->13%（15min）->45%（15.1min）->49%（35min）->49%（36min）->100%（36.1min）->100%（40min）->13%（40.1min）->13%（50min）
流 速： 0.5 mL / min
柱 温： 30°C
进样量： 5μL
检 测： α-熊果苷、β-熊果苷的激发波长为292，发射波长为337；氢醌的激发波长为298，发射波长为345；苯酚的激发波长为280，发射波长为318
样 品： α-熊果苷2μg/mL ；β-熊果苷2μg/mL；氢醌0.2μg/mL；苯酚0.4μg/mL (溶剂为甲醇)
标准曲线
用甲醇将固体标准品溶解稀释配制成标准工作溶液，浓度依次由低向高进样测定，以峰面积-浓度作图，绘制标准工作曲线。标准曲线在浓度范围内线性良好，线性系数r的范围为0.9998~0.9999。测试结果如表4所示。
表4 α-熊果苷、β-熊果苷、氢醌和苯酚的线性方程、线性范围和相关系数
回收率
按照标准方法分别对化妆水和乳液样品进行加标回收实验，α-熊果苷和β-熊果苷添加量为20μg，氢醌添加量为2μg，苯酚添加量为4μg。对样品和加标样品进行分析，计算得到回收率结果，分析谱图如图6和图7所示。化妆水样品和乳液样品加标回收率范围为88.4%~99.9%，回收率较好。
图6 化妆水样品和化妆水加标样品分析图
1.β-熊果苷 2.α-熊果苷 3.氢醌 4.苯酚
图7 乳液样品和乳液加标样品分析图（样品中苯酚有值需要质谱确认）
1.β-熊果苷 2.α-熊果苷 3.氢醌 4.苯酚
【色谱条件】
色谱柱： CAPCELL PAK ADME HR, 4.6 mm×250 mm, 5 μm（V45HAD01279）
流动相： A：水 B：甲醇
B%13%（0min）->13%（15min）->45%（15.1min）->49%（35min）->49%（36min）->100%（36.1min）->100%（40min）->13%（40.1min）->13%（50min）
流 速： 0.5 mL / min
柱 温： 30°C
进样量： 5μL
检 测： α-熊果苷、β-熊果苷的激发波长为292，发射波长为337；氢醌的激发波长为298，发射波长为345；苯酚的激发波长为280，发射波长为318
样 品： 称取样品1.0g（精确到0.001g），置10mL具塞比色管中，加入甲醇至10mL，在涡旋混匀器上高速振荡30s，使样品与提取溶剂充分混合。密塞，超声提取20min，静置至室温，取适量样品溶液离心（转速14000r/min）5min，取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为待测溶液。必要时用适量甲醇稀释。
结论
综上，参考《化妆品安全技术规范 （2015年版）》第四章理化检验方法中8.2化妆品中α-熊果苷等4种原料的检验方法，使用CAPCELL PAK C18 MGIII S5;4.6×250色谱柱可以得到α-熊果苷和β-熊果苷较好的分离，目标峰线性和回收率良好。
使用CAPCELL PAK ADME-HR S5;4.6×250色谱柱，对检验方法进行调整后，可得到良好分析结果，线性和回收率良好，同时α-熊果苷和β-熊果苷的分离度可达到3.58，并缩短了测试时间。