8.3 化妆品中联苯乙烯二苯基二磺酸二钠等5种原料的检验方法 CP柱推荐
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国家药品监督管理局发布了“国家药监局关于将油包水类化妆品的pH值测定方法等21项制修订项目纳入化妆品安全技术规范（2015年版）的通告（2023年第41号）”。
新增14项检验方法，纳入《化妆品安全技术规范（2015年版）》，自通告发布之日起实施。
今天给大家带来的是“化妆品中联苯乙烯二苯基二磺酸二钠等5种原料的检验方法”的数据分享和CP色谱柱推荐。
按照标准检验方法，分别用CAPCELL PAK C18 MGII和CAPCELL PAK C18 BB色谱柱对5种组分进行测定，同时也测定了化妆水、乳液、面霜样品并对化妆水做了加标回收率测试。
1. 高效液相色谱法（CAPCELL PAK C18 MGII）分析结果
1.1 标准品分析结果
按照检验方法，使用色谱柱CAPCELL PAK C18 MGII S5, 4.6 mm×250 mm对标准品进行分析，结果如图1所示。5种标准物质的理论塔板数为6275~168626，分离度均达到基线分离要求。
注：峰上标由下至上分别为分离度、保留时间、理论塔板数
图1 C18 MGII色谱柱分析结果-标准溶液
【色谱条件】
色谱柱：CP C18 MGII S5, 4.6 mm×250 mm
流动相：A：25 mmol/L乙酸铵溶液，用氨水调节pH至8.0，过滤 B：乙腈
B% 30%(0 min)-30%(10 min)-90%(16 min)-90%(20 min)-98%(20.1 min)-98%(38 min)-30%(40 min)-30%(45 min)
流 速：1.0 mL/min
柱 温：35 °C
进样量：10 μL
检 测：激发波长，360；发射波长，440
样 品：1.4,4'-双[(4-苯胺基-6-羟乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠盐(500 ng/mL)，2.联苯乙烯二苯基二磺酸二钠(50 ng/mL)，3.二乙氨基甲基香豆素(50 ng/mL)，4.二苯并噁唑基萘(50 ng/mL)，5.双(叔丁基苯并噁唑基)噻吩(50 ng/mL)，(溶剂为70% 25 mmol/L乙酸铵溶液(用氨水调节pH至8.0) + 30% 乙腈)
1.2 方法学考察
1.2.1 标准曲线的绘制
用N,N-二甲基甲酰胺溶解后初始比例流动相最终稀释配制成标准工作溶液，浓度依次由低向高进样测定，以峰面积-浓度作图，绘制标准工作曲线，如表1所示。标准曲线在浓度范围内线性良好，线性系数r的范围为0.9953~0.9999。
表1 线性范围、标曲、相关系数
1.2.2 样品测试
按照标准方法分别对水剂、乳剂、霜剂样品进行测试，测试结果如图2所示，样品均未达到标准中要求的最低定量浓度。同时对水剂进行加标测试，回收率为82%~119%。
图2 水、乳、霜样品分析图
1.3 分析注意事项
1.3.1 标准品
4,4'-双[(4-苯胺基-6-羟乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠盐出峰前后均有杂质峰干扰，我们尝试了降低初始有机相比例到27%（30%→27%）来提高目标峰和杂质峰之间的分离度，测试结果如图3所示。
图3 方法优化前后对比图
1.3.2 空白干扰
在进行空白溶剂和标准品测试时，发现空白溶剂峰对目标峰有干扰，测试结果如图4所示
图4 空白干扰
为改善梯度空白的影响，我们尝试在泵后连接鬼峰捕集柱，测试结果如图5所示，加入鬼峰捕集柱（Ghost-Cleaner I）后干扰峰明显减少。
图5空白干扰
2. 高效液相色谱法（CAPCELL PAK C18 BB）分析结果
2.1 标准品分析结果
由于检验方法中流动相pH相对较高，因此我们也尝试用耐碱型CAPCELL PAK C18 BB S5, 4.6 mm×250 mm对标准品进行分析，5种目标物均能很好分离，但是目标峰4,4'-双[(4-苯胺基-6-羟乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠盐和前后杂质之间未达到基线分离，我们尝试降低有机相的初始比例到27%进行测试，测试结果如图6-7所示。目标峰4,4'-双[(4-苯胺基-6-羟乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠盐和前后杂质分离度均在3.0以上。
注：峰上标为分离度
图6 方法优化前后对比结果
注：峰上标由下至上分别为分离度、保留时间、理论塔板数
图7 方法优化后标准品测试结果
【色谱条件】
色谱柱：CP C18 BB S5, 4.6 mm×250 mm
流动相：A：25 mmol/L乙酸铵溶液，用氨水调节pH至8.0，过滤 B：乙腈
B% 27%(0 min)-27%(10 min)-90%(16 min)-90%(20 min)-98%(20.1 min)-98%(38 min)-27%(40 min)-27%(45 min)
流 速：1.0 mL/min
柱 温：35 °C
进样量：10 μL
检 测：激发波长，360；发射波长，440
样 品：1.4,4'-双[(4-苯胺基-6-羟乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠盐(500 ng/mL)，2.联苯乙烯二苯基二磺酸二钠(50 ng/mL)，3.二乙氨基甲基香豆素(50 ng/mL)，4.二苯并噁唑基萘(50 ng/mL)，5.双(叔丁基苯并噁唑基)噻吩(50 ng/mL)，(溶剂为70% 25 mmol/L乙酸铵溶液(用氨水调节pH至8.0) + 30% 乙腈)
2.2 方法学考察
2.2.1标准曲线的绘制
用N,N-二甲基甲酰胺溶解后初始比例流动相最终稀释配制成标准工作溶液，浓度依次由低向高进样测定，以峰面积-浓度作图，绘制标准工作曲线，如表2所示。标准曲线在浓度范围内线性良好，线性系数r的范围为0.9993~0.9994。
表2 线性范围、标曲、相关系数
2.2.2 样品测试
按照标准方法分别对水剂、乳剂、霜剂样品进行测试，测试结果如图8所示，样品均未达到标准中要求的最低定量浓度。同时对水剂进行加标测试，回收率为83%~117%。
图8水、乳、霜样品分析图
综上，参考《化妆品安全技术规范 （2015年版）》第四章理化检验方法中8.3化妆品中联苯乙烯二苯基二磺酸二钠等5种原料的检验方法，使用CAPCELL PAK C18 MGII S5, 4.6 mm×250 mm色谱柱可以得到良好分析结果，线性、回收率良好，且目标峰和杂质峰之间能够达到基线分离。
使用CAPCELL PAK C18 BB S5, 4.6 mm×250 mm色谱柱，在降低初始有机相比例到27%时，也能达到目标峰和杂质峰的基线分离同时也可以得到良好分析结果，线性、回收率良好。
因为方法中流动相A的pH值为8，为了延长色谱柱的使用寿命，建议及时冲洗色谱柱并保存在高有机相下。