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PC HILIC

HILIC 色谱柱


HILIC是Hydrophilic Interaction Chromatography的简称,即“亲水性相互作用色谱”。在HILIC模式下,通过键合极性官能团的固定相与反相模式常用的CH3CN / H2O系流动相的组合,来对亲水性化合物进行保留与分离,因此,HILIC是在HPLC的分离模式中最常使用的反相模式的反相,故也被称为“反反相模式”。PC HILIC色谱柱将构成细胞膜的成分作为官能团,对亲水性化合物的保留具有优势。

 

物性值

官能团 细孔径
(nm)
粒径
(μm)
比表面积
(m2/g)
pH范围
PC(磷酸胆碱基) 10 5 450 3~7.5
PC(磷酸胆碱基) 10 3 450 3~7.5

 

HILIC模式是指

 

 

在HILIC模式下,亲水性的固定相表面形成了水和相,样品的分配在流动相与水和相之间进行。因此,与水和相亲和力较强的极性化合物会被保留,而弱极性化合物基本不被保留,很快被溶出。因为显示出与反相模式相反的分离模式,对在反相模式下难以取得保留的极性化合物能够发挥优势。如下图所示,通过提高流动相中有机相的比例,在HILIC模式下极性化合物的保留得到了增强。

 

保留行为随乙腈比例的变化

 


色谱柱:PC HILIC S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm
流动相:10 mmol/L HCOONH4, x% CH3CN
流 速:1.0 mL/min
温 度:40℃
检 测:UV 254 nm
样 品:①萘 ②胸腺嘧啶 ③腺嘌呤 ④胞核嘧啶

 

PC是指


磷酸胆碱(PC)是构成细胞膜的成分,具有甜菜碱结构,拥有高亲水性和生体适应性,能抑制蛋白质的吸附。

 


PC HILIC是将资生堂的填料合成技术应用于资生堂独有的PC填料素材而诞生的HILIC模式用色谱柱。在硅胶基材表面以PC基团进行修饰,实现了适用于HILIC色谱柱的超亲水性填料的制造。与以未修饰硅胶作为填料的硅胶色谱柱相比,PC HILIC的亲水性更强,对极性化合物核酸碱基的保留更强。

 

PC的超亲水性

 


色谱柱:PC HILIC S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm
流动相:10 mmol/L CH3COONH4, CH3CN / H2O = 90 / 10
流 速:1.0 mL/min
温 度:40℃
检 测:UV 254 nm
样 品:①萘 ②胸腺嘧啶 ③胞核嘧啶

 

对极性化合物的保留强

高理论塔板数

碱性化合物以对称、尖锐的峰形出峰

 

尿囊素


下图为对中性化合物尿囊素的分析结果。
尿囊素虽为中性化合物,但极性很强,在反相色谱柱上很难得到保留,而适用于分析极性化合物的PC HILIC能对尿囊素得到充分的保留与分离。

 

 

阿米替林

 

对于在反相模式下经常引起拖尾的碱性化合物代表——阿米替林进行分析。由于PC HILIC色谱柱中,以PC对硅胶表面进行了均匀的修饰,因此水和相与流动相之间的分配能平滑顺利地进行,不会出现峰形拖尾的现象,理论塔板数也非常高。

 

 

色谱柱:PC HILIC S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm
流动相:10 mmol/L CH3COONH4, CH3CN / H2O = 90 / 10
流 速:1.0 mL/min
温 度:30℃
检 测:UV 254 nm
样 品:阿米替林

 

核酸碱基

 

在酸性条件下对极性化合物核酸碱基进行分析。PC HILIC色谱柱与其他公司的HILIC色谱柱相比,因其具有超强亲水性,对核酸碱基得到了良好保留,有利于分离。另外,理论塔板数也很高,峰形也很尖锐。

 

 

色谱柱:S5; 4.6 mm i.d. × 250 mm
流动相:10 mmol/L HCOONH4 (pH 3.5) / CH3CN = 10 / 90
流 速:1.0 mL/min
温 度:40℃
检 测:UV 254 nm
样 品:①萘 ②胸腺嘧啶 ③腺嘌呤 ④胞核嘧啶

 

产品一览表

■PC HILIC
产品编号 类型 粒径
(μm)
内径
(mm)
长度
(mm)
F93152 PC HILIC 3 2.0 50
F93154 PC HILIC 3 2.0 100
F93155 PC HILIC 3 2.0 150
F93162 PC HILIC 3 4.6 50
F93165 PC HILIC 3 4.6 100
F93102 PC HILIC 5 2.0 50
F93104 PC HILIC 5 2.0 100
F93105 PC HILIC 5 2.0 150
F93106 PC HILIC 5 2.0 250
F93112 PC HILIC 5 4.6 50
F93114 PC HILIC 5 4.6 100
F93115 PC HILIC 5 4.6 150
F93116 PC HILIC 5 4.6 250
F93120 PC HILIC 5 10 20G*
F93125 PC HILIC 5 10 150
F93126 PC HILIC 5 10 250
F93140 PC HILIC柱芯(2PCS) 5 2.0 10
F93141 PC HILIC柱芯(2PCS) 5 4.0 10
F93145 PC HILIC柱芯(2PCS) 3 2.0 10
F93146 PC HILIC柱芯(2PCS) 3 4.0 10

 *G : 保护柱

 

PC HILIC高效液相色谱柱使用说明书

 

在此,非常感谢您选购我公司的PC HILIC色谱柱。
PC HILIC采用了多孔球型硅胶基质表面键合磷酸胆碱(PC)的填料。
为了能够长期且稳定地使用PC HILIC色谱柱,请在熟读该使用说明书后进行正确使用。

色谱柱的使用

1) 强烈撞击可能会造成色谱柱劣化,请小心谨慎使用。
2) 请在压力指示为0时进行色谱柱的安装和拆卸。
3) 色谱柱最大使用压为20 MPa。

色谱柱的安装

1) 色谱柱的接头使用了外径1/16英寸配管的螺头(MALE NUT)。请确保装置的配管接头正确连接,并且锥箍的顶端已插入接头内侧(参照图1)。
2) 安装色谱柱之前,请将装置配管内的液体置换成所用的流动相。
※请确认色谱柱出厂时的溶剂(记录在色谱柱附带的报告中),并注意盐析现象等。
3) 请按照色谱柱标签上的箭头方向来安装色谱柱。

分析

 

流动相


1) PC HILIC采用HILIC模式进行分离,请使用CH3CN/H2O系作为流动相。一般CH3CN的浓度在70%以上时可形成HILIC模式,同时,为了形成HILIC模式,H2O的浓度至少要在3%以上。另外,流动相的缓冲溶液推荐采用在高浓度有机溶剂中也有高溶解性的醋酸铵或甲酸铵。
2) PC HILIC的流动相推荐最佳pH使用范围为3~7.5。可用pH范围是以保留时间和理论塔板数不会提早减少为评价基准的。
3) 请过滤(0.45 μm以下滤膜)流动相去除杂质后再进行充分脱气。
4) 为防止由异物导致的色谱柱入口处过滤筛板堵塞,建议使用线上过滤器。
5) 新色谱柱使用色谱柱报告中标示的流动相封存。若要置换成含无机盐的流动相,请注意置换程序,不要造成盐析出。
6) 以下使用方法一般会导致色谱柱劣化,故应避免此类操作。
频繁变更流动相的组成或直接变更为相溶性差的流动相
色谱柱入口压力的急剧变化
使用高粘度的流动相造成高柱压

 

样品溶液的配制


1) 请尽量将样品溶解在与流动相组成相同的溶剂中。
2) 若使用含水量高的溶剂,会造成分离能力降低。因此推荐使用含有机溶剂50%以上的溶液进行稀释。
3) 样品溶液的pH请不要超过色谱柱的可用pH范围。

色谱柱的保存

1) 请用附带的堵头密封,保存在温差小的阴冷处。
2) 若是一个月以上的长期保存,使用不含盐的溶剂冲洗后,用出厂时的溶剂置换并用附带的堵头密封,保存在温差小的阴冷处。

色谱柱的连接

请按照图1所示进行配管连接。若配管不匹配,特别是直接使用其他类型色谱柱所用配管时,锥箍前端的长度(图1中的V)与尾端接头的长度(图1中的L)经常会不同,因而引发故障。
若L>V,会产生死体积,甚至出现色谱峰展宽或拖尾现象,并且分离变差。
若L<V,由于锥箍无法密封,所以会导致漏液。
※ 频繁更换色谱柱,可能会导致螺头的锥箍损坏而发生漏液现象。这种情况下若进一步拧紧,螺母的头部可能会发生断裂。

图1 色谱柱的连接图

 

故障与对策

使用高效液相色谱法进行测定时所出现的问题,存在各种原因。但由于无法将其一一列举,故在此只说明色谱柱及其周边较容易出现的问题。

 

问题现象 原因 对策
色谱柱压升高 异物堵塞
①流动相、样品溶液中杂质、不溶物
②配管内的水垢
③活塞密封圈的碎片
④样品成分的析出
・预先用滤膜对流动相、样品溶液进行过滤。
・安装线上过滤器。
・清理配管及更换活塞密封圈。
・使用流动相配制样品溶液。
色谱峰分裂、拖尾、展宽 ①由于配管连接错误导致产生死体积
②流动相条件不适合
・离子抑制法:抑制不充分(样品量过多)
・离子对法:离子对试剂浓度不足(样品量过多)
③色谱柱劣化
※若色谱柱劣化或填充层出现裂隙,则无法进行修复。
・重新连接配管。
・考察pH、盐浓度、样品量等。
・考察离子对试剂浓度、pH、样品量等。
・通过柱效检测来确认色谱柱性能
保留时间延迟或不稳定 ①漏液(根据泵压值进行判断)
②流动相条件不适合
③色谱柱的平衡时间不够
・检查泵、配管系列的漏液情况。
・充分平衡。
保留时间变短 ①使用强酸或碱导致配位基断裂(劣化)
②流动相条件不适合
③色谱柱的平衡时间不够
・充分平衡。

 

PC HILIC在出厂前已进行了严格的性能检查。但是万一出现不合格产品,请麻烦您联系我公司。
但是,若未按照色谱柱寿命相关事项或上述使用注意事项进行使用而导致劣化时,我们不能承担该类责任,望请谅解。
收到商品后10天以内若无投诉,即可认定为合格品。在此之后不能再更换,望请谅解。

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