三耀精细化工品销售（北京）有限公司

阀切换系统实现奶粉中维生素D的高灵敏度分析

周提军 荒井裕子 城田 修
（资生堂（中国）投资有限公司）

摘要：

通过阀切换方式使食品中低含量的营养素分析变得准确、快捷。奶粉中维生素D的分析时，存在杂质对样品的分离干扰严重、分离困难的共通现象，本实验通过阀切换系统对大部分杂质进行弃除，仅将含有目标物质的部分切换到分析系统中，在分析系统中进行二次分离，有效改善了分离效果，同时由于只让少量杂质进入色谱柱，起到了保护色谱柱，延长色谱柱使用寿命的效果。
Abstract: Column-switching methods to analyze trace amount of nutrititives in food more accurately and quickly were developed. Matrices in food sample are known to badly interfere with determination of nutritives, such as vitamin D in milk powder. The methods are designed to remove most of impurities with a column-switching process, which only transfer the analyte-containing fraction to a secondary separation. The new analytical method were found to improve both separation efficiency and lifetime of the analytical column。
关键词：阀切换，维生素D

1、介绍

维生素D为固醇类衍生物，能够促进钙、磷的吸收，具有预防和治疗佝偻病的功效。为防治婴儿佝偻病及成人骨质软化症，常被应用于强化食品，奶粉中应用尤为常见。但由于奶粉中脂溶性物质较多，对维生素D的分析有比较大的影响，由于不能进行更好的分析，所以定量不太容易。现有方法先通过正相系统制备维生素D，然后通过反向系统进行分析，操作比较繁琐。为了更简单的进行分析，我们开发了使用半微柱HPLC的柱切换法进行分析，该方法更加准确、快捷。

2、实验部分

2.1.仪器与试剂
半微柱高效液相色谱仪（大阪曹達），高压切换阀（大阪曹達），二极管阵列检测器（Thermo），旋转蒸发仪（EYELA VACUUM CONTROLLER NVC-1100），高纯氮气瓶，万分之一天平（METTLER TOLEDO），恒温磁力搅拌器（MAG-MIXER MH301）。

超纯水（MILLIPORE,UltrapUre Ion-Ex-TM），无水硫酸钠（分析纯），无水乙醇（分析纯），异丙醇（色谱纯），正己烷（色谱纯），石油醚（分析纯，沸程30℃~60℃），维生素C的乙醇溶液（15g/L），氢氧化钾水溶液（250g固体氢氧化钾加入200mL水中溶解），维生素D3标准品（百灵威购买），荷兰某品牌奶粉。
2.2 实验方法
2.2.1样品处理
称取10g奶粉样品于250mL三角瓶中，用50mL 45℃~50℃超纯水使其溶解，混合均匀。于上述处理的试样溶液中加入约100mL维生素C的乙醇溶液，充分混匀后加入25mL氢氧化钾水溶液混匀，放入磁力搅拌棒，充氮气排出空气，盖上胶塞。1000mL烧杯中加入约300mL的水，当水温控制在53±2℃时，将三角瓶放入烧杯中，磁力搅拌皂化约45分钟，取出后冷却到室温。用少量水将皂化液全部转入500ml分液漏斗中，加入100mL石油醚，轻轻摇动，室温下振荡约10分钟后静止分层，将水相转入到另一500mL分液漏斗中，按上述方法进行第二次萃取，合并醚液，水洗至中性。醚液通过无水硫酸钠过滤脱水，滤液收入500mL圆底烧瓶中，于旋转蒸发器上在40℃±2℃条件下蒸至近干。残渣用少量石油醚转移至小烧杯中，用氮气吹干后用3mL正己烷溶解，待测。
2.2.2标准溶液的配置
称取10.4mg维生素D3于100mL容量瓶中用正己烷溶解定容，取100μL标准溶液用900μL正己烷进行10倍稀释，该稀释溶液分别用移液枪吸取20μL、40μL、60μL、80μL、100μL用正己烷配置成0.2μg/mL、0.4μg/mL、0.6μg/mL、0.8μg/mL、1.0μg/mL的标准溶液。
2.2.3色谱分析条件
色谱柱初次分离时使用 CAPCELL PAK NH2 UG80 S5 2.0mm i.d.×150mm，二次分离时使用 Silica SG80 S5 2.0mm i.d.×250mm 2根串联；初次分离流动相为正己烷：异丙醇（98/2 ,v/v），二次分离流动相为正己烷：异丙醇（95/5 ,v/v）；流速200μL/min；检测器PDA265nm；温度40℃；进样量10μL；阀切换：从开始到4.8分钟以内，阀处于位置A，4.8分钟到6.5分钟，阀切换到B的位置，6.5分钟后，阀切换到A的位置，运行到分析结束,装置流路见图1。
【装置流路】

3、结果与讨论。

3.1流动相的选择
初次分离流动相比较了不同比例的正己烷异丙醇比例，分别尝试了正己烷：异丙醇（99/1 ,v/v）、正己烷：异丙醇（95/5 ,v/v）；其中正己烷：异丙醇（99/1 ,v/v）时样品扩散较大，正己烷：异丙醇（95/5 ,v/v）时保留时间太短，而正己烷：异丙醇（98/2 ,v/v）时，保留时间及峰扩散较好，故初次分离流动相选择正己烷：异丙醇（98/2 ,v/v）。
二次分离流动相选择正己烷：异丙醇（98/2 ,v/v）时，保留时间过长，峰形扩散严重，正己烷：异丙醇（92/8 ,v/v）时，不能将维生素D与杂质很好的分离，而正己烷：异丙醇（95/5 ,v/v）能够较好的分离，且峰形良好。见图2、图3.

图2维生素D标准品

 

维生素D样品图

3.2样品前处理条件的选择
分别在奶粉中加入正己烷直接萃取、加入水溶解奶粉后直接用正己烷萃取。其中直接加入正己烷萃取，无法将维生素D萃取出来，加水溶解后的样品不经过皂化直接萃取时，会出现大量的乳化层，在分层时造成困难，会有部分样品丢失，检测结果偏低，最后选择了国标前处理方法，即上述前处理方法。
3.3切换时间的选择
在初次分离流动相条件下确定维生素D的保留时间5.4min，峰宽0.4min，即5.2min出峰，5.6min峰结束，但实际上在5.2min时样品已经到达检测器，所以切换时间需要提前，考虑到色谱柱随着使用次数的增加，样品的保留时间可能会发生变化，所以，在保证杂质对分离没有影响的情况下，切换时间范围大一些，本实验考查在4.8min-6.5min的切换时间分析结果较好。见图4。

图4 切换示意图

3.4维生素D的确认
通过标准品保留时间及维生素D全扫描光谱图来确认，相似度0.9945，可以确定图示物质为维生素D，见图5。

图5 维生素D确认

3.5标准曲线和线性范围
在本实验的色谱条件下，对维生素D3标准品进行分析，在0.2~1μg/ml范围内有良好的线性关系，回归方程Y =1.74181e-006x - 0.00662911，相关系数r=0.9956，以三倍信噪比计算，检出限为0.01μg/ml，定量限为0.2mg/kg。
3.6精密度实验
选择1.0μg/ml的维生素标准品溶液按照上述色谱条件进行检测，分别连续进样6次，测得峰面积的RSD分别为2.12%，结果显示本实验的精密度较高。

3.7加标回收实验
准确称取6份已知含量的样品，再准确加入维生素D标准品，按照2.2.1处理溶液，测定其中维生素D的含量，得到平均回收率为 96.8%，加标回收率均符合要求（见表1）
表1 加标回收率试验结果

4.结论

本文提出了阀切换方法在奶粉中维生素D分析上的应用。在维生素D的分析中，通过阀切换的方式使得杂质通过阀切换去除，在二次分析时得到较好效果。该方法具有简单、快速、准确的特点，能够为含有复杂基质食品中低含量物质的检测提供更好的方案。

【参考文献】
[1]中华人民共和国卫生部 食品安全国家标准GB5413.9-2010
[2]Aya Hirayama,Hiroshi Kubo,Masashi Mita,Osamu Shirota,Yorihiro Yamamoto. Journal of Chromatographic Science, p 717-721, 46, 2008
[3]吴怀春 程华等 高效液相色谱法测定强化奶及食品中维生素D含量