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GB 5009.82-2016 食品中维生素E的分析-CAPCELL PAK PFP

维生素E（Vitamin E）是一种脂溶性维生素，其水解产物为生育酚，是最主要的抗氧化剂之一。维生素E对免疫系统功能的发挥起着重要的作用，调节血小板的黏附力，防止血小板凝结。同时，维生素E作为抗氧化剂，能防止暴露于自由基而造成的细胞损伤。
《GB 5009.82-2016 食品安全国家标准 食品中维生素A、D、E的测定》中，色谱条件规定如下：

5.3 色谱参考条件
色谱参考条件列出如下:
a) 色谱柱:C₃₀柱(柱长250 mm,内径4.6 mm,粒径3 μm),或相当者;
b) 柱温:20℃;
c) 流动相:A:水;B:甲醇,洗脱梯度见表1;
d) 流速:0.8 mL/min;
e) 紫外检测波长:维生素A 为325 nm;维生素E 为294 nm;
f) 进样量:10 μL;
g) 标准色谱图和样品色谱图见C.1。
注1:如难以将柱温控制在20℃±2℃,可改用PFP柱分离异构体,流动相为水和甲醇梯度洗脱。
注2:如样品中只含α-生育酚,不需分离β-生育酚和γ-生育酚,可选用C18柱,流动相为甲醇。
注3:如有荧光检测器,可选用荧光检测器检测,对生育酚的检测有更高的灵敏度和选择性,可按以下检测波长检测:维生素A激发波长328 nm,发射波长440 nm;维生素E激发波长294 nm,发射波长328 nm。

然而在实际工作中，C₃₀色谱柱可能并不是很常用，将柱温控制在20℃±2℃也比较有难度，而寻找其他替代柱也需花费时间、精力和人力去摸索条件，将为繁忙的检测、研究工作带来不必要的麻烦。
因此，大阪曹達尝试使用键合五氟苯基的全多孔型色谱柱CAPCELL PAK PFP进行分析，在简单的等度条件下即实现了4种维生素E的快速保留与良好分离；同时，PFP色谱柱对异构体拆分等方面的分析也具有优势，可作为常备柱，是您工作的好帮手！
废话不多说，让我们来看看数据吧～

α-, β-, γ-, δ-维生素E结构式如下：

 

使用CAPCELL PAK PFP色谱柱对这4种维生素E进行分析，结果如图1所示。

 

图1 CAPCELL PAK PFP色谱柱分析色谱图

 

*注：峰上标数字为分离度。

HPLC Conditions
色谱柱： CAPCELL PAK PFP S5; 4.6mm i.d.×250mm
流动相： 水/ 甲醇= 10/ 90
流　速： 1mL/ min
温　度： 35°C
检　测： PDA 292nm
进样量： 5µL

如图1，在简单的等度条件下即可完成4种维生素E的良好保留与分离。
其中，δ-与β-维生素E间分离度为3.92，β-与γ-维生素E间分离度为1.96，γ-与α-维生素E间分离度为3.73，均符合分离度要求。

接下来，为提供更多色谱柱选择，我们在该条件下对比了下列3款具有不同特性的色谱柱：
★SPOLAR C18——对脂溶性维生素具有一定拆分能力的普适型C18柱
★SUPERIOREX ODS——高含碳量C18柱（含碳量为24%）
★CAPCELL PAK ADME——键合立体笼状金刚烷基团、对同分异构体具有一定拆分能力

 

结果如图2、3所示：

 

图2 SPOLAR C18色谱柱分析色谱图

 

图3 CAPCELL PAK ADME色谱柱色谱图

 

HPLC Conditions
色谱柱： SPOLAR C18 / CAPCELL PAK ADME S5; 4.6mm i.d.×250mm
流动相： 水/ 甲醇= 10/ 90
流　速： 1mL/ min
温　度： 35°C
检　测： PDA 292nm
进样量： 5µL
样　品： α, β, γ, δ-维生素E的浓度分别为180µg/mL, 372.2µg/mL, 159.2µg/mL, 170µg/mL

 

由图2、图3可知，在SPOLAR C18及CAPCELL PAK ADME色谱柱上，4种维生素E在50min内均未能得到有效分离。
而在C18 SUPERIOREX ODS色谱柱上，4种维生素E在70min内尚未溶出（在此未给出该结果）。对此，继续使用该色谱柱，将流动相更换为100%甲醇、100%乙腈分别进行尝试，结果如图4。

 

图4 SUPERIOREX ODS色谱柱分析色谱图

 

HPLC Conditions
色谱柱： SUPERIOREX ODS S5; 4.6mm i.d.×250 mm
流动相： 100%甲醇; 100%乙腈
流　速： 1mL/ min
温　度： 35°C
检　测： PDA 292nm
进样量： 5µL
样　品： α, β, γ, δ-维生素E的浓度分别为180µg/mL, 372.2µg/mL, 159.2µg/mL, 170µg/mL

 

如图4，使用C₁₈ ODS色谱柱在100%有机相条件下依然未能取得4种维生素E的有效分离。

综上所述，使用键合五氟苯基的全多孔型色谱柱CAPCELL PAK PFP，在水 / 甲醇 = 10 / 90的等度条件下，对4种维生素E进行分析，可在16min内得到各物质之间的良好分离与保留；而不论是对脂溶性维生素具有一定拆分能力的普适型色谱柱SPOLAR C₁₈、含碳量高达24%的C₁₈柱SUPERIOREX ODS，还是具有同分异构体拆分能力的CAPCELL PAK ADME色谱柱，均未能得到良好结果。

结论：本数据充分体现了CAPCELL PAK PFP色谱柱具有的特殊分离选择性。